Хроматографія – це один з методів розділення речовин. Вона використовується для подальшого якісного і кількісного аналізу фізичних і хімічних властивостей мікрочастинок. Різновидом даної технології є аффинная хроматографія. Ідея диференціації білкових сполук з використанням властивості спорідненості молекул відома в науці вже кілька десятиліть. Однак свій розвиток вона отримала тільки в останні роки, після того, як були впроваджені високопористі гідрофільні матеріали, що використовуються в якості матриці. Даний метод дозволяє вирішувати як аналітичні задачі (поділ речовин та їх ідентифікація), так і препаративні (очищення, концентрування).

Сутність

Афінна хроматографія (від латинського слова affіnіs – «суміжний», «споріднений») заснована на афінних взаємодіях, які являють собою утворення високо специфічних зв'язків між молекулою-роздільником (лігандом або аффинантом) і цільової молекулою. Ці механізми широко поширені в природі (зв'язок медіаторів або гормонів і рецепторів, антитіл і антигенів, гібридизація полінуклеотидів та інші види процесів). У медицині аффинная хроматографія почала застосовуватися в практичних цілях починаючи з 1951 р.

Поділ компонентів відбувається наступним чином:

робочий розчин, що містить речовину, яку необхідно виділити, пропускають через сорбент;

ліганд, нанесений на матрицю-сорбент, утримує це речовина;

відбувається його концентрування (накопичення);

вилучення виділеного речовини з сорбенту за допомогою вимивання розчинником.

Даний спосіб дозволяє виділити цілі клітини. Відмінністю від традиційної сорбційної хроматографії є те, що існує міцне биоспецифическое зв'язування виділяється компонента з сорбентом, що характеризується високою вибірковістю.

Адсорбенти

В якості адсорбентів застосовують такі речовини:

Гелевидні склади на основі агарози – полісахариду, одержуваного з агару. Найбільш часто використовують 3 різновиди: сефарозу 4 CL (зшита агароза) і аффи-гель. Останній склад являє собою модифікований гель з агарози та поліакриламіду. Він володіє більшою біологічною інертністю, високою хімічною і термічною стійкістю.

Кремнезем (силікагель).

Скло.

Органічні полімери.

Для усунення механічних перешкод при контакті ліганду застосовують додаткові речовини, що відокремлюють його від носія (пептиди, диамины, поліаміни, олігосахариди).

Апаратура

Обладнання для афінної хроматографії включає в свій склад наступні основні вузли:

ємкості-накопичувачі для рухомої фази (елюентів);

насоси високого тиску для подачі середовища (найчастіше поршневі);

фільтр для очищення елюентів від пилу;

дозуючий пристрій;

хроматографічний колона для розділення суміші;

детектор для визначення розділених компонентів, що виходять з колони;

реєстратори хроматограмм і мікропроцесорний блок (ЕОМ).

З метою зменшення кількості розчиненого повітря через рухливу фазу попередньо пропускають гелій. Для зміни концентрації елюентів встановлюють кілька насосів, керованих програматором. Хроматографічні колони виготовляються з нержавіючої сталі (при підвищених вимогах до корозійної стійкості), зі скла (універсальний варіант) або з акрилу. Для препаративних цілей їх діаметр може коливатися від 2 до 70 див. В аналітичній хроматографії застосовують микроколонки ?10-150 мкм. Для підвищення чутливості детекторів в суміш вводяться реагенти, які сприяють утворенню речовин, які більше поглинають промені в ультрафіолетовій або видимій області спектра.

Методика проведення

Розрізняють 2 основних види рідинної афінної хроматографії:

Колоночная, при якій колону заповнюють нерухомою фазою і через неї пропускають суміш з потоком елюентів. Поділ може відбуватися під тиском або під внаслідок дії сили тяжіння.

Тонкошарова. Елюенти рухається по плоскому шарі адсорбенту під впливом капілярних сил. Адсорбент наносять на пластину зі скла, керамічний або кварцову паличку, металеву фольгу.

Основні етапи робіт включають в себе:

підготовка адсорбенту, фіксація ліганду на носії;

подача суміші для поділу в хроматографічну колону;

завантаження рухомої фази, зв'язування компонента лігандом;

заміна фази для виділення пов'язаного речовини.

Призначення

Афінна хроматографія використовується для виділення наступних видів речовин (у дужках зазначений вид застосовуваного при цьому ліганду):

аналоги інгібіторів ферментативних, субстратів і кофакторів (ферменти);

біоорганічні речовини, що володіють ознаками генетичної чужорідності, віруси і клітини (антитіла);

високомолекулярні вуглеводи, полімери моносахаридів, глікопротеїни (лектини);

ядерні білки, нуклеотидилтрансферазы (нуклеїнові кислоти);

рецептори, транспортні білки (вітаміни, гормони);

білки, що взаємодіють із клітинними мембранами (клітини).

Ця технологія також використовується для одержання іммобілізованих ферментів, а прив'язка їх до целюлозі дозволяє виготовити імуносорбенти.

Хроматографія ДНК-зв'язуючих білків

Виділення ДНК-зв'язуючих білків здійснюється за допомогою гепарину. Цей глікозаміноглікан здатний зв'язувати великий діапазон молекул. Афінна хроматографія білків цієї групи використовується для виділення таких речовин, як:

фактори ініціації і елонгації трансляції (синтез молекул нуклеїнових кислот і білків);

рестриктази (ферменти, які впізнають певні послідовності в дволанцюжкової ДНК);

ДНК-лігази і полімерази (ферменти, що каталізують з'єднання двох молекул з утворенням нового хімічного зв'язку і беруть участь у реплікації ДНК);

інгібітори серинових протеаз, які відіграють важливу роль в імунних і запальних процесах;

фактори зростання: фібробластів, Шванна, ендотеліальний;

білки міжклітинного матриксу;

рецептори гормонів;

ліпопротеїди.

Переваги

Даний метод є одним з найбільш специфічних для виділення реакційноздатних сполук (ферментів і більш великих агрегатів – вірусів). Проте він використовується не тільки для виділення біологічно активних речовин.

Виявлення антитіл в малих кількостях, кількісна оцінка полиадениловой кислоти, експрес-визначення молекулярних мас дегідрогеназ, видалення певних забруднювачів, вивчення кінетики активації неактивної форми трипсину, молекулярної будови інтерферонів людини – ось далеко не весь перелік досліджень, при яких застосовується аффинная хроматографія. Застосування в клініці обумовлено такими її перевагами, як:

Можливість ефективного очищення білків, полісахаридів, нуклеїнових кислот. Вони дещо відрізняються за своїми фізико-хімічними властивостями і втрачають свою активність при гідролізі, денатурації та інших видах впливу, що використовуються в інших методах.

Швидкість розділення речовин, динамічний характер процесу.

Відсутність необхідності в спеціальному очищенню ферментів і гомогенізації ізоферментів для визначення констант дисоціації.

Можливість поділу широкого кола речовин.

Невеликий витрата лігандів.

Можливість поділу речовин у великих обсягах.

Оборотний процес зв'язування біологічних макромолекул.

Дану методику можна поєднувати з іншими, накладати додаткове поле (гравітаційне, електромагнітне). Це дозволяє розширити технічні можливості хроматографії.

Ферментна інженерія

Завдяки цьому методу почався активний розвиток нової галузі біотехнологій – ферментної інженерії. Афінна хроматографія стосовно виділення ферментів володіє наступними перевагами:

отримання ферментів у великих кількостях в результаті менших затрат часу, як результат – їх здешевлення;

іммобілізація ферментів дозволяє значно розширити область їх застосування в медицині та промисловості;

зв'язок ферментів з нерозчинної твердою підкладкою дає можливість вивчити вплив мікрооточення і напрямок реакцій, які грають важливу роль в природних і фізіологічних процесах.