» » Афінна хроматографія в медицині: особливості та застосування

Афінна хроматографія в медицині: особливості та застосування

Хроматографія – це один з методів розділення речовин. Вона використовується для подальшого якісного і кількісного аналізу фізичних і хімічних властивостей мікрочастинок. Різновидом даної технології є аффинная хроматографія. Ідея диференціації білкових сполук з використанням властивості спорідненості молекул відома в науці вже кілька десятиліть. Однак свій розвиток вона отримала тільки в останні роки, після того, як були впроваджені високопористі гідрофільні матеріали, що використовуються в якості матриці. Даний метод дозволяє вирішувати як аналітичні задачі (поділ речовин та їх ідентифікація), так і препаративні (очищення, концентрування).

Сутність

Афінна хроматографія в медицині: особливості та застосування
Афінна хроматографія (від латинського слова affіnіs – «суміжний», «споріднений») заснована на афінних взаємодіях, які являють собою утворення високо специфічних зв'язків між молекулою-роздільником (лігандом або аффинантом) і цільової молекулою. Ці механізми широко поширені в природі (зв'язок медіаторів або гормонів і рецепторів, антитіл і антигенів, гібридизація полінуклеотидів та інші види процесів). У медицині аффинная хроматографія почала застосовуватися в практичних цілях починаючи з 1951 р.

Поділ компонентів відбувається наступним чином:
  • робочий розчин, що містить речовину, яку необхідно виділити, пропускають через сорбент;
  • ліганд, нанесений на матрицю-сорбент, утримує це речовина;
  • відбувається його концентрування (накопичення);
  • вилучення виділеного речовини з сорбенту за допомогою вимивання розчинником.
  • Даний спосіб дозволяє виділити цілі клітини. Відмінністю від традиційної сорбційної хроматографії є те, що існує міцне биоспецифическое зв'язування виділяється компонента з сорбентом, що характеризується високою вибірковістю.

    Адсорбенти

    Афінна хроматографія в медицині: особливості та застосування
    В якості адсорбентів застосовують такі речовини:
  • Гелевидні склади на основі агарози – полісахариду, одержуваного з агару. Найбільш часто використовують 3 різновиди: сефарозу 4 CL (зшита агароза) і аффи-гель. Останній склад являє собою модифікований гель з агарози та поліакриламіду. Він володіє більшою біологічною інертністю, високою хімічною і термічною стійкістю.
  • Кремнезем (силікагель).
  • Скло.
  • Органічні полімери.
  • Для усунення механічних перешкод при контакті ліганду застосовують додаткові речовини, що відокремлюють його від носія (пептиди, диамины, поліаміни, олігосахариди).

    Апаратура

    Афінна хроматографія в медицині: особливості та застосування
    Обладнання для афінної хроматографії включає в свій склад наступні основні вузли:
  • ємкості-накопичувачі для рухомої фази (елюентів);
  • насоси високого тиску для подачі середовища (найчастіше поршневі);
  • фільтр для очищення елюентів від пилу;
  • дозуючий пристрій;
  • хроматографічний колона для розділення суміші;
  • детектор для визначення розділених компонентів, що виходять з колони;
  • реєстратори хроматограмм і мікропроцесорний блок (ЕОМ).
  • З метою зменшення кількості розчиненого повітря через рухливу фазу попередньо пропускають гелій. Для зміни концентрації елюентів встановлюють кілька насосів, керованих програматором. Хроматографічні колони виготовляються з нержавіючої сталі (при підвищених вимогах до корозійної стійкості), зі скла (універсальний варіант) або з акрилу. Для препаративних цілей їх діаметр може коливатися від 2 до 70 див. В аналітичній хроматографії застосовують микроколонки ?10-150 мкм. Для підвищення чутливості детекторів в суміш вводяться реагенти, які сприяють утворенню речовин, які більше поглинають промені в ультрафіолетовій або видимій області спектра.

    Методика проведення

    Афінна хроматографія в медицині: особливості та застосування
    Розрізняють 2 основних види рідинної афінної хроматографії:
  • Колоночная, при якій колону заповнюють нерухомою фазою і через неї пропускають суміш з потоком елюентів. Поділ може відбуватися під тиском або під внаслідок дії сили тяжіння.
  • Тонкошарова. Елюенти рухається по плоскому шарі адсорбенту під впливом капілярних сил. Адсорбент наносять на пластину зі скла, керамічний або кварцову паличку, металеву фольгу.
  • Основні етапи робіт включають в себе:
  • підготовка адсорбенту, фіксація ліганду на носії;
  • подача суміші для поділу в хроматографічну колону;
  • завантаження рухомої фази, зв'язування компонента лігандом;
  • заміна фази для виділення пов'язаного речовини.
  • Призначення

    Афінна хроматографія в медицині: особливості та застосування
    Афінна хроматографія використовується для виділення наступних видів речовин (у дужках зазначений вид застосовуваного при цьому ліганду):
  • аналоги інгібіторів ферментативних, субстратів і кофакторів (ферменти);
  • біоорганічні речовини, що володіють ознаками генетичної чужорідності, віруси і клітини (антитіла);
  • високомолекулярні вуглеводи, полімери моносахаридів, глікопротеїни (лектини);
  • ядерні білки, нуклеотидилтрансферазы (нуклеїнові кислоти);
  • рецептори, транспортні білки (вітаміни, гормони);
  • білки, що взаємодіють із клітинними мембранами (клітини).
  • Ця технологія також використовується для одержання іммобілізованих ферментів, а прив'язка їх до целюлозі дозволяє виготовити імуносорбенти.

    Хроматографія ДНК-зв'язуючих білків

    Виділення ДНК-зв'язуючих білків здійснюється за допомогою гепарину. Цей глікозаміноглікан здатний зв'язувати великий діапазон молекул. Афінна хроматографія білків цієї групи використовується для виділення таких речовин, як:
  • фактори ініціації і елонгації трансляції (синтез молекул нуклеїнових кислот і білків);
  • рестриктази (ферменти, які впізнають певні послідовності в дволанцюжкової ДНК);
  • ДНК-лігази і полімерази (ферменти, що каталізують з'єднання двох молекул з утворенням нового хімічного зв'язку і беруть участь у реплікації ДНК);
  • інгібітори серинових протеаз, які відіграють важливу роль в імунних і запальних процесах;
  • фактори зростання: фібробластів, Шванна, ендотеліальний;
  • білки міжклітинного матриксу;
  • рецептори гормонів;
  • ліпопротеїди.
  • Переваги

    Афінна хроматографія в медицині: особливості та застосування
    Даний метод є одним з найбільш специфічних для виділення реакційноздатних сполук (ферментів і більш великих агрегатів – вірусів). Проте він використовується не тільки для виділення біологічно активних речовин.

    Виявлення антитіл в малих кількостях, кількісна оцінка полиадениловой кислоти, експрес-визначення молекулярних мас дегідрогеназ, видалення певних забруднювачів, вивчення кінетики активації неактивної форми трипсину, молекулярної будови інтерферонів людини – ось далеко не весь перелік досліджень, при яких застосовується аффинная хроматографія. Застосування в клініці обумовлено такими її перевагами, як:
  • Можливість ефективного очищення білків, полісахаридів, нуклеїнових кислот. Вони дещо відрізняються за своїми фізико-хімічними властивостями і втрачають свою активність при гідролізі, денатурації та інших видах впливу, що використовуються в інших методах.
  • Швидкість розділення речовин, динамічний характер процесу.
  • Відсутність необхідності в спеціальному очищенню ферментів і гомогенізації ізоферментів для визначення констант дисоціації.
  • Можливість поділу широкого кола речовин.
  • Невеликий витрата лігандів.
  • Можливість поділу речовин у великих обсягах.
  • Оборотний процес зв'язування біологічних макромолекул.
  • Дану методику можна поєднувати з іншими, накладати додаткове поле (гравітаційне, електромагнітне). Це дозволяє розширити технічні можливості хроматографії.

    Ферментна інженерія

    Завдяки цьому методу почався активний розвиток нової галузі біотехнологій – ферментної інженерії. Афінна хроматографія стосовно виділення ферментів володіє наступними перевагами:
  • отримання ферментів у великих кількостях в результаті менших затрат часу, як результат – їх здешевлення;
  • іммобілізація ферментів дозволяє значно розширити область їх застосування в медицині та промисловості;
  • зв'язок ферментів з нерозчинної твердою підкладкою дає можливість вивчити вплив мікрооточення і напрямок реакцій, які грають важливу роль в природних і фізіологічних процесах.
  • 173