» » Рекомбінантна ДНК: опис, характеристики

Рекомбінантна ДНК: опис, характеристики

Рекомбінантна ДНК - це молекули, утворені лабораторними методами генетичної рекомбінації для об'єднання генетичного матеріалу з безлічі джерел. Вона можлива тому, що молекули ДНК всіх організмів мають однакову хімічну структуру і відрізняються тільки нуклеотидної послідовністю в її межах.

Створення

Молекулярне клонування - це лабораторний процес, який використовується для створення рекомбінантних ДНК. Це один з двох найбільш широко використовуваних методів, поряд з полімеразної ланцюгової реакції (ПЦР). Він дозволяє управляти реплікацією будь-якої конкретної послідовності ДНК, виділеної експериментатором. Є два фундаментальних відмінності між методами рекомбінантних ДНК. Одним з них є те, що молекулярне клонування включає реплікацію в живій клітині, а ПЛР - в пробірці. Інша відмінність полягає в тому, що перший метод припускає вирізання та вставлення послідовностей ДНК, а другий посилюється шляхом копіювання існуючої черговості.
Рекомбінантна ДНК: опис, характеристики

Вектор ДНК

Отримання рекомбінантної ДНК вимагає клонуючого вектора. Він походить від плазмід або вірусів і являє собою відносно невеликий сегмент. Вибір вектора для молекулярного клонування залежить від вибору організму-господаря, розміру клонируемой ДНК і від того, чи повинні экспрессироваться чужорідні молекули. Сегменти можуть бути об'єднані з використанням різних методів, таких як клонування рестриктази /лігази або Складання Гібсона.

Клонування

В стандартних протоколах клонування включає сім етапів.
  • Вибір організму-господаря і вектора клонування.
  • Одержання ДНК-вектора.
  • Формування клонируемой ДНК.
  • Створення рекомбінантної ДНК.
  • Введення її в організм господаря.
  • Відбір організмів, що її містять.
  • Вибір клонів з бажаними вставками ДНК і біологічними властивостями.
  • Після трансплантації в організм господаря чужорідні молекули, що містяться в рекомбінантної конструкції, можуть экспрессироваться або неэкспрессироваться. Експресія вимагає реструктуризації гена для включення послідовностей, які необхідні для продукування ДНК. Вона використовується трансляційний апаратом господаря.
    Рекомбінантна ДНК: опис, характеристики

    Як працює

    Рекомбінантна ДНК працює, коли клітина-господар экспрессирует білок з рекомбінантних генів. Експресія залежить від оточення гена набором сигналів, які забезпечують інструкції для його транскрипції. Вони включають в себе промотор, зв'язування рибосоми і термінатор. Проблеми виникають, якщо ген містить интроны або сигнали, які діють як термінатори для бактеріального господаря. Це призводить до передчасного припинення. Рекомбінантний білок може бути неправильно оброблений, згорнуть або підданий розкладанню. Його виробництво в эукариотических системах зазвичай відбувається в дріжджах і нитчастих грибах. Використання тварин клітин утруднене із-за того, що багатьом потрібна міцна опорна поверхня.

    Рекомбінантна ДНК: опис, характеристики

    Властивості організмів

    Організми, що містять рекомбінантні молекули ДНК, мають явно нормальні фенотипом. Їх зовнішній вигляд, поведінка і метаболізм зазвичай не змінюються. Єдиний спосіб продемонструвати наявність рекомбінантних послідовностей - це досліджувати саму ДНК з використанням тесту полімеразної ланцюгової реакції. У деяких випадках рекомбінантна ДНК може чинити шкідливий вплив. Це може статися, коли її фрагмент, що містить активний промотор, розташовується поруч із раніше мовчить геном клітини-господаря.

    Використання

    Технологія рекомбінантної ДНК широко використовується у біотехнології, медицині та дослідженнях. Її білки та інші продукти можна знайти практично у кожній західній аптеці, ветклініці, кабінеті лікаря, медичної або біологічної лабораторії. Найбільш поширеним застосуванням є фундаментальне дослідження, в якому технологія важлива для більшості сучасних робіт в біологічних і біомедичних науках. Рекомбінантна ДНК використовується для ідентифікації, картування і послідовності генів, а також для визначення їх функції. Зонди рДНК використовуються для аналізу експресії генів в окремих клітинах і тканинах цілих організмів. Рекомбінантні білки використовуються в якості реагентів в лабораторних експериментах. Деякі конкретні приклади наведені нижче.
    Рекомбінантна ДНК: опис, характеристики

    Рекомбінантний хімозин

    Знайдений у сичузі, хімозин являє собою фермент, необхідний для виробництва сиру. Це була перша генетично модифікована харчова добавка, яка використовується в промисловості. Мікробіологічно продуцированный рекомбінантний фермент, структурно ідентичний ферменту, отриманого від теляти, коштує дешевше і виробляється у великих кількостях.

    Рекомбінантний людський інсулін

    Практично повністю замінив інсулін, отриманий з джерел тварин (наприклад, свиней і великої рогатої худоби) для лікування інсулінозалежного діабету. Рекомбінантний інсулін синтезується шляхом введення гена людського інсуліну бактерії роду этерихий або дріжджі.
    Рекомбінантна ДНК: опис, характеристики

    Гормон росту

    Призначається пацієнтам, у яких гіпофіз генерує недостатню кількість гормону росту для підтримки нормального розвитку. До того, як став доступний рекомбінантний гормон росту, його отримували з гіпофіза трупів. Ця небезпечна практика призвела до того, що у деяких пацієнтів розвинулася хвороба Крейтцфельда-Якоба.

    Рекомбінантний фактор згортання крові

    Це згортаючий кров білок, який вводять пацієнтам з формами гемофілії з порушенням згортання крові. Вони не здатні продукувати фактор VIII в достатніх кількостях. До розробки рекомбінантного фактора VIII білок виходив шляхом обробки великої кількості крові людини від декількох донорів. Це несло дуже високий ризик передачі інфекційних захворювань.

    Діагностика зараження ВІЛ

    Кожен з трьох широко використовуваних методів діагностики ВІЛ-інфекції був розроблений з використанням рекомбінантної ДНК. Тест на антитіла використовують її білок. Він визначає наявність генетичного матеріалу ВІЛ за допомогою полімеразної ланцюгової реакції зі зворотною транскрипцією. Розробка тесту стала можливою завдяки молекулярного клонування та аналізу послідовності геномів ВІЛ.
    36